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冷冻干燥与液氮保藏菌种技术
点击次数:1018 发布时间:2018-01-19
 建议用下列方法恢复培养冷冻干燥保藏的菌种。

一、安瓶管开封 :

1.用浸过70%酒精的脱脂棉擦净安瓿管。

2.用火焰将安瓿管顶端加热。

3.滴无菌水至加热的安瓿管顶端使玻璃开裂。

4.用挫刀或镊子敲下已开裂的安瓿管的顶端。

二、菌株恢复培养 :

1.用无菌吸管,吸取0.3~0.5ml适宜的液体培养基,滴人安瓿管内,轻轻振荡,使冻于菌体溶解呈悬浮状。

2.取0.1~0.2ml菌体悬浮液,移植于适宜的琼脂斜面/平板培养基上,剩余的菌液,注入适宜的液体培养基内,然后在建议的温度下培养。

3.若未能活化,或活化后有疑问时,请于收到菌种1个月内,通知保藏中心,经查证无误后,即免费补寄。

三、注意事项 :

1.菌种活化前,请将安瓿管保存在6一10℃的环境下。

2.厌氧菌的培养,如无特别说明,自开封至接种完成,均需以无氧气体充填,以保持厌氧状态。

3.某些菌种经过冷冻干燥保存后,延迟期较长,需连续两次继代培养才能正常生长,此时请将步骤二(2)重复一次。

< 液氮超低温保藏程序 >

1、容器的选择:使用带螺旋盖的2ml塑料安培瓶。

2、检查安培瓶是否渗漏:用0.05%的亚甲基蓝水溶液在4℃浸泡30-45分钟,冲洗干净,弃去含有蓝色染料的安培瓶,其余的安培瓶备用。

3、打印标签(激光打印)。

4、容器的灭菌:先用蒸馏水漂洗干净安培瓶,再用蒸馏水在灭菌锅中121℃浸泡灭菌15分钟,干燥并将打印好的标签放入安培瓶中,略拧紧螺旋盖,再行121℃灭菌30分钟。

5、保藏菌菌龄:处于zui大生长量阶段或对数生长期后期。

6、保护剂:选用5-10%的甘油或二甲基亚砜作保护剂。

1)甘油的准备:在121℃灭菌15分钟,2-8℃贮存。甘油一般以两倍zui终所需浓度的水溶液保存,然后与同等量的细胞悬液混合。若不用细胞悬液,则以zui终所需浓度的水溶液保存。

2)二甲基亚砜:用0.22um的聚四氟乙烯过滤膜过滤除菌。过滤膜预先用甲醇和二甲基亚砜漂洗。无菌的二甲基亚砜以10-15ml装量2-8℃避光保存。

7、分装:在无菌条件下,将细胞悬液(从平板上打下直径为5cm的菌块)分装于安培瓶中,并注入保护剂,拧紧螺旋盖。 传代细胞

8、将安培瓶固定在铝夹上,贴好标签。为了便于取用,一般一个铝夹上仅放一个菌株。

9、将控温系统先预冷到4℃,再将铝夹放入其中。以每分钟1℃降温至-40℃,然后以每分钟10℃降温至-90℃。降温以后,将铝夹转移至处于液氮中的储存器中保存。

10、菌种的复活:将液氮保藏的菌种取出,迅速放入37℃水浴中解冻。一般需2至2.5分钟,等完全解冻后,再及时转接到合适的培养基中培养。 

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